Zentrum für mikrobielle Einzelzell-RNA-seq (MICROSEQ)

Genetisch identische Bakterien können phänotypisch vielfältig sein. Ein Beispiel dafür sind die Bacteroidota, ein vorherrschendes Bakterienphylum in der menschlichen Darmmikrobiota. Die molekularen Grundlagen der morphologischen Heterogenität von Bacteroidota-Arten und ihre potenziellen funktionellen Konsequenzen sind jedoch nur unzureichend bekannt. In diesem Projekt entwickeln wir einen sensitiven transkriptomischen Ansatz, um zellgrößenbezogene Genexpressionsmuster zu erfassen. Das Protokoll basiert auf der MATQ-seq-Methode, die wir hier für B. thetaiotaomicron optimieren, kombiniert mit der CRISPR/Cas-basierten Abreicherung ribosomaler Sequenzen. Wir zeigen, dass unsere transkriptomische Pipeline die Genexpression auf genomischer Ebene genau quantifiziert. Ihre Anwendung zur Sortierung gesammelter B. thetaiotaomicron-Zellen unterschiedlicher Größe ermöglicht es uns, morphologische Markergene abzuleiten, deren Expression in Bakterienzellen bestimmter Größe angereichert ist. 

Diese morphologischen Markergene, die z. B. Proteine kodieren, die am Zellzyklus, am Primär- und Sekundärstoffwechsel und an membranassoziierten Prozessen beteiligt sind, werden mithilfe von Einzelmolekül-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung validiert. Da die mikrobielle Heterogenität zu einem immer wichtigeren Thema in der Mikrobiota-Forschung geworden ist, könnte diese Studie als Blaupause dienen, um verschiedene Phänotypen mit Funktionen in immer größerer Auflösung zu verknüpfen.

Für die Entwicklung neuer therapeutischer Optionen ist das Verständnis der zellulären Reaktionen in pathogenen Bakterien während der Infektion von entscheidender Bedeutung. Wir untersuchen, welchen Beitrag die heterogene Expression von Virulenzfaktoren zu klinisch relevanten Phänotypen des anaeroben, grampositiven Erregers Clostridioides difficile leistet. Während der Infektion entscheiden sich die Zellen von C. difficile auf sehr heterogene Weise entweder für die Produktion von Toxinen oder die Sporulation. Dabei lösen einzelne Subpopulationen entweder die eine oder die andere Reaktion aus. Diese phänotypische Heterogenität ist wahrscheinlich entscheidend für die erfolgreiche Besiedlung des Darms durch C. difficile und die Übertragung auf neue Wirte. Welche Faktoren das Schicksal einer einzelnen Bakterienzelle bestimmen, ist jedoch nicht gut bekannt. Wir wollen untersuchen, welche extrazellulären Signale die Entscheidungen innerhalb einer einzelnen Zelle beeinflussen und welche zellulären Zustände mit den verschiedenen Virulenzprogrammen von C. difficile verbunden sind. Mithilfe der bakteriellen Einzelzell-RNA-Sequenzierung wollen wir die transkriptionellen und posttranskriptionellen Regulatoren identifizieren, die diese Entscheidungen beeinflussen, und charakterisieren, wie sie zu einer erfolgreichen Infektion durch C. difficile beitragen.